大規模金屬礦藏的開采，產生了大量硫化金屬尾礦如黃鐵礦、砷黃鐵礦等. 這些尾礦給環境帶來了很大威脅，如長期暴露于空氣中，則會與微生物和水發生風化、 溶浸、 氧化和水解一系列反應形成酸性礦山廢水(acid mine drainage,AMD)[1]. 酸性礦山廢水pH非常低且含有大量金屬離子，如鐵、 銅、 鋅、 錳等，對周圍水體、 土壤環境帶來了十分嚴重的危害[2,3]. 在黃鐵礦等硫化礦物的氧化過程中，Leptospirillum ferrooxidans、 Acidithiobacillus ferrooxidans和Ferroplasma spp.等嗜酸微生物發揮著重要的催化作用[4]. 有嗜酸微生物參與時，黃鐵礦的氧化速率明顯高于化學氧化對黃鐵礦的氧化作用，在適宜條件下它們可使整個反應的速度提高106倍[5].

　　低pH和高金屬含量不僅影響周圍地區的生態系統，而且影響元素的生物地球化學循環. 氮循環是元素地球化學循環中非常重要的一部分. 氮循環主要由固氮、 氨化、 硝化、 反硝化等過程組成，均由微生物驅動. 氨氧化過程不僅是硝化作用的限速步驟，更是整個氮元素循環的中心環節[6,7]. 在很長一段時間里，氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)被認為是唯一可以催化氨氧化的微生物[8]，其存在直接影響硝化作用強度以及硝化速率[9]. 但近幾年的研究卻發現，氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)廣泛地分布在海洋、 土壤、 沉積物、 淡水以及污水處理廠等諸多環境中[10]，而且在大多數土壤中AOA是主要的氨氧化承擔者[11]. 已有研究表明，在pH 3.7~6.0的酸性紅壤中，氨氧化古菌(AOA)的氨單加氧酶α亞基基因(amoA)拷貝數多于細菌amoA[11]，表明氨氧化古菌可能發揮著更重要的作用. 但關于pH小于3的極端酸性環境中氨氧化類群的研究，目前還鮮見報道.

　　本研究取樣點位于安徽省某酸性礦山廢水區域，采集有短小植被覆蓋區域的根際土壤，采用分子生物學技術分析其細菌和古菌的組成結構并探討承擔氨氧化功能的微生物類群. 研究結果不但有助于人們增加對礦區土壤微生物組成的了解，而且擴展了人們對極端酸性土壤中氮循環機制的認識，有利于對污染土壤的生物治理和生態恢復.

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品采集及分析

　　樣品于2012年8月采集于安徽某鐵礦酸性礦山廢水庫邊有短小植被覆蓋區域. 采集根際土壤樣品后，裝于無菌封口袋中，4℃保存運輸至實驗室并盡快進行實驗操作. 取100 g土壤研磨過1 mm篩，以去除植物根系; 將50 g過篩的土壤50℃烘干24 h，計算含水率. 用KCl溶液作為介質測定樣品pH. 總有機碳(total organic carbon,TOC)含量由總有機碳測定分析儀Multi N/C 2100測定. 氨氮和硝氮含量采用氯化鉀溶液提取-分光光度法測定[12]. 使用M3浸提劑[13]制備浸提液，用于有效磷和有效金屬的測定. 使用經離心后的浸提液，采用鉬銻抗分光光度法測定有效磷含量[14]. 有效金屬含量采用ICP(iCAP 6000,Thermo)測定，具體測定方法見文獻[15]. 土壤中微生物豐度(Microbial abundance)采用吖啶橙染色直接計數法(acridine orange direct counting,AODC)測定，具體方法見文獻[16].

　　1.2 土壤基因組DNA的提取

　　取0.5 g土壤樣品，用基因組DNA提取試劑盒直接提取樣品中的總DNA(參照MoBio試劑盒生產商建議步驟). 提取出來的基因組總DNA經Nanodrop測定DNA濃度后置于-20℃保存.

　　1.3 細菌16S rRNA基因的擴增

　　利用細菌通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[17]，以土壤基因組DNA為模板，擴增樣品中細菌的16S rDNA基因片段. PCR反應條件設置為預變性95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火53℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35個循環后，72℃延伸7 min. 所有PCR產物都在-20℃保存.

　　1.4 古菌16S rRNA基因的擴增

　　以土壤基因組DNA為模板，利用古菌通用引物109F(ACK GCT CAG TAA CAC GT)和934R(GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT)[18]擴增樣品中古細菌的16S rRNA基因片段. PCR反應條件設置為預變性95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火48℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35個循環后，72℃延伸5 min.

　　1.5 氨單加氧酶基因(amoA)的擴增

　　amoA是氨氧化功能酶——氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)α亞基的編碼基因. 以土壤基因組DNA模板，分別利用氨氧化細菌amoA引物amoA-1F(GGG GHT TYT ACT GGT GGT)和amoA-2R(CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC)[19]、 amoA-3F(GGT GAG TGG GYT AAC MG)和amoA-4R(GCT AGC CAC TTT CTG G)[20]，氨氧化古菌amoA引物AF(STA ATG GTC TGG CTT AGA)和AR(GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT)[21]擴增樣品中氨氧化細菌和氨氧化古菌的氨單加氧酶基因片段. 氨氧化細菌PCR反應條件設置為95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火48℃ 45 s，延伸72℃ 2 min，35個循環后，72℃延伸10 min. 氨氧化古菌PCR反應條件設置為95℃ 5 min，變性94℃ 30 s，退火48℃ 60 s，延伸72℃ 2 min，35個循環后，72℃延伸10 min.

　　1.6 克隆文庫的構建

　　分別構建土壤樣品中細菌和古細菌的16S rDNA克隆文庫以及氨氧化古菌的amoA克隆文庫. 氨氧化細菌amoA基因經反復擴增，均未得到PCR產物，故未構建該文庫. 克隆文庫構建方法為：將PCR產物連接到Promega公司的pGEM-T克隆載體上，按照生產商的說明將質粒轉化于E. coli DH5α感受態細胞中，涂布于含有Amp/X-gal/IPTG的LB平板，于37℃靜置培養17 h，之后在4℃靜置2 h顯色，隨機挑取白色菌落，重新培養. 利用載體特異性引物對M13-M4(GTT TTC CCA GTC ACG AC)和M13-RV(CAG GAA ACA GCT ATG AC)進行PCR擴增驗證插入片段大小以篩選陽性克隆. 細菌、 古菌和氨氧化古菌克隆文庫分別挑取105、 38和43個陽性克隆送交上海生工進行測序.

　　1.7 序列測定以及系統發育分析

　　利用Bellerophon程序檢測并去除嵌合體[22]. 然后用Dotur軟件對所得序列進行分類，計算香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)并制作飽和曲線. 最后選取代表克隆運用Blast程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中進行相似性搜索并下載相似性最高的序列和相似性較高的已知種屬的序列. 將所有序列用BioEdit中的ClustalW程序進行比對，并用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹.

　　1.8 序列登錄號

　　將本研究中所得序列提交至GenBank中，細菌16S rDNA的序列登錄號為KF863913-KF863952，KF924200-KF924205; 古菌16S rDNA的序列登錄號為KF918278-KF918306; 氨氧化古菌amoA的序列登錄號為KF916687-KF916696.

　　2 結果與分析

　　2.1 AODC結果與理化分析

　　所采集土壤樣品的部分物理化學參數見表 1. 樣品酸性很強，pHKCl僅為2.83. 總有機碳含量為0.675%，低于農田和森林土壤TOC平均含量[23,24]; 含水率為9.5%; 土壤微生物豐度為3.1×108 個 ·g-1; NH+4-N和NO-3-N含量分別為7.6 mg ·kg-1、 3.1 mg ·kg-1. 經測得樣品中有效金屬含量很高，其中Al含量最高達1 380.3 mg ·kg-1，Fe含量高達57.0 mg ·kg-1. SO2-4含量高達2 168.0 mg ·kg-1.

　　表 1 土壤樣品的部分化學參數

　　2.2 飽和度及多樣性指數分析

　　經測序細菌文庫共獲得103條序列，去除載體和嵌合體后有效序列為95條; 古細菌與氨氧化古菌文庫分別得到28條和39條有效序列. 3個文庫的飽和曲線如圖 1所示，3個文庫飽和曲線均趨于平緩，可以比較完整地反映樣品中細菌、 古菌和氨氧化古菌群落結構. 從香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)可以看出該樣品中細菌的多樣性高于古菌(表 2).

　　圖1 細菌、 古菌和氨氧化古菌飽和度曲線

　　表 2 細菌、 古菌以及氨氧化古菌克隆文庫多樣性指數

　　2.3 土壤中細菌、 古菌以及氨氧化古菌多樣性以及系統發育學分析 2.3.1 細菌多樣性以及系統發育分析

　　將每種基因型的序列輸入RDP網站，得到該基因型所屬的系統發育類群. 結果顯示，細菌文庫中包含了11個類群(如圖 2)，其中所占比例最大的3個類群分別為Acidobacteria(47.4%)、 Verrucomicrobia(18.9%)、 Chloroflexi(10.5%).

　　圖 2 細菌文庫中各類群所占比例

　　經NCBI數據庫中Blast程序比對分析后，選取主要克隆進行比對，發現與該礦區土壤樣品中細菌親緣關系較近的克隆均來自于一些酸性環境中，如某些礦區酸性土壤、 酸性濕地底泥、 酸性紅壤和酸性礦山廢水等，或者植被根際等.

　　本研究中酸桿菌門是所占比例最高的門類，在文庫中豐度達47.4%. 酸桿菌門細菌在環境中分布廣泛，尤其在土壤和沉積物中所占比例較高——在細菌16S rRNA基因文庫中的豐度可達10%~50%[25, 26, 27, 28, 29, 30]. 該樣品中酸桿菌門細菌多屬于Gp1類群(如圖 3). 酸桿菌門的一些成員對于極端環境如金屬污染和酸性環境具有耐受性[26].Lee等[29]在研究韓國某地栗子樹根際土壤時，分別應用PCR以及反轉錄PCR(reverse transcription PCR)研究土壤樣品中微生物多樣性，在rRNA基因文庫以及由rRNA反轉錄得到的cDNA文庫中，酸桿菌門所占比例都大于50%，表明酸桿菌門細菌在該土壤樣品中數量最多而且新陳代謝活性最高.

　　圖 3 基于16S rDNA序列的Acidobacteria細菌系統發育樹

　　克隆Bac-XC-105(2.0%)、 Bac-XC-109(5.1%)、 Bac-XC-19(1.0%)和Bac-XC-25(1.0%)均與Candidatus Koribacter versatilis 的親緣關系較近. Ward等[31]比較了包括Candidatus Koribacter versatilis在內的酸桿菌門中3個種的全基因組，發現Candidatus Koribacter versatilis具備硝酸鹽和亞硝酸鹽還原能力，且適宜在pH 4.0~6.5的環境中生存.

　　克隆Bac-XC-27(4.0%)、 Bac-XC-86(1.0%)和Bac-XC-99(1.0%)與菌株Acidobacteria sp. isolate N3B的16S rDNA序列相似性均為97%，該菌株分離自法國加爾省一流經古代礦區的酸性溪流中[32]. Acidobacteria屬菌株多為分離自酸性環境的化能異養菌，革蘭氏染色呈陰性，好氧; 可在pH 3.0~6.0、 溫度為20~37℃的環境中生存[33].

　　克隆Bac-XC-14和Bac-XC-4(豐度分別為4.0%和3.0%)與Holophaga sp.的16S rDNA序列同源性較高. Holophaga屬細菌在一些酸性礦坑水中曾檢測到，如江西德興市銀山鉛鋅礦的露天礦坑儲水池和地下300多m隧道中自然氧化形成的酸性礦坑水[34]. Holophaga屬細菌多為革蘭氏陰性嚴格厭氧菌，可在溫度為10~35℃環境中生存，最適溫度為28~32℃，最適pH為6.8~7.5[35].

　　克隆Bac-XC-41(5.1%)和Bac-XC-80(2.0%)在系統發育樹上與Acidopila rosea聚為一類(圖 3). Okamura等[36]分別在日本的一個AMD處理廠(水樣pH 2.7)和一個茶葉種植園土壤(pH 4.5)中分離到兩株Acidipila rosea. Acidipila rosea為革蘭氏陰性好氧菌，細胞呈球形或球桿形，營養類型為化能有機營養型; 可以在pH 3.0~6.0范圍內生存，最適pH為4.5; pH 7.0時不能生存.

　　如圖 4所示，放線菌門包括3種基因型(占文庫的4.0%)都與Aciditerrimonas ferrireducens在系統發育樹上聚為一簇. Aciditerrimonas ferrireducens是一種中度嗜熱的嗜酸菌，具有還原鐵的能力; 革蘭氏染色呈陽性，可以在pH 2.0~4.5，溫度35~58℃的環境中生存，最適pH為3.0，最適生長溫度為50℃. 有氧條件下營養類型為化能異養，無氧環境中為化能自養，利用三價鐵氧化氫獲得能量[37].

　　圖 4 基于16S rDNA序列的其它門細菌系統發育樹

　　α-變形菌門在本文庫中所占比例僅為6.0%. 其中克隆Bac-XC-102(3.0%)與紅游動菌屬(Rhodoplanes sp.)Z2-YC6860在系統發育樹上聚為一簇. 紅游動菌屬細菌為一類紫色非硫細菌; 細胞革蘭氏染色呈陰性，兼性厭氧光能營養型細菌，細胞含有類胡蘿卜素和菌綠素; 該類細菌在黑暗厭氧條件下可以完成反硝化過程進行脫氮[38].

　　2.3.2 古菌多樣性以及系統發育分析

　　經過RDP網站的比對分析，本研究的土壤樣品中古菌屬于兩個類群，即廣古菌門(Euryarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota). 測試的29個克隆分屬于14個操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)，其中10個OTUs(22個克隆)屬于奇古菌門，4個OTUs(7個克隆)屬于廣古菌門. 與細菌相比，古菌多樣性明顯較低. 通過系統發育分析發現該土壤樣品中古菌與氨氧化作用密切相關.

　　奇古菌門是2008年從中溫環境來源的古菌(溫泉古菌)劃分出來的一個新類群[39]. 古菌文庫中歸類于奇古菌門的古細菌均與氨氧化作用相關. 奇古菌門的氨氧化古菌分布廣泛，在沉積物、 土壤、 淡水以及海洋環境中其amoA含量顯著高于氨氧化細菌[40]. 一些研究運用抑制劑抑制硝化作用結合使用穩定性同位素探測技術(stable isotope probing,SIP)等證明了氨氧化古菌在一些自然環境尤其是寡營養環境的硝化作用中起重要作用[13, 39, 40].

　　奇古菌門中比例最高也是文庫中豐度最大的基因型為Arch-XC-25，所占比例為27.6%. 在GenBank數據庫的比對結果中，與該克隆親緣關系較近的均為未培養菌株(如圖 5)，多數檢測自土壤和沉積物中; 其中相似度為99%的一個序列分離自美國橡樹嶺Melton河支流流域沿岸pH為4.5的土壤樣品. 克隆Arc-XC-13在文庫中豐度為13.8%，與該克隆親緣關系最近的克隆來自金屬礦區(如鈾尾礦)和酸性泉水. 基因型Arc-XC-11和Arc-XC-27各包含兩個克隆(豐度為6.9%)，其余基因型均為單克隆. 與這些基因型相似的序列多分離自酸性紅壤、 酸性礦山廢水、 酸性溫泉以及植物根際土壤等. 在GenBank數據庫中與本研究中所有古菌基因型相似度在93%以上的都為未得到純培養的古菌的16S rDNA序列. 而去除未培養古菌的序列后，本研究中所有古菌的序列類型都與Nitrososphaera(亞硝化球菌屬)親緣關系最近，相似度為81%~87%. Nitrososphaera 屬的Nitrososphaera viennensis EN76(維也納亞硝化球菌)是第一株分離自土壤環境的氨氧化古菌[41]; Nitrososphaera gargensis(加爾加亞硝化球菌)分離自俄羅斯加爾加地區的一個溫泉，具有氧化氨的能力，但是氨濃度超過3 mmol ·L-1會抑制其生長[42]. 分離自英格蘭酸性土壤(pH 4.5)的Nitrosotalea devanaterra(阿伯丁土壤亞硝化細桿菌)是1株嗜酸氨氧化古菌，pH 4~5時均生長良好，當pH>5.5時生長會受到抑制; 最適生長溫度為25℃[43]. 已有研究表明，在酸性土壤中，AOA與硝化潛勢存在明顯正相關關系，主導氨氧化過程的發生[43]. 本研究土壤也具有類似特點，氨氧化過程可能主要由氨氧化古菌驅動.

　　圖 5 基于16S rDNA序列的古菌系統發育樹

　　本研究的文庫中廣古菌門包括3種基因型，其中基因型Arc-XC-22豐度最大，為13.8%. 這3種基因型的最相似序列均分離自哥倫比亞安第斯山脈的一個酸性溫泉[44]和日本箱根大涌谷的一個酸性溫泉[45]. 克隆Arc-XC-3與數據庫中序列相似度低于80%，可能是廣古菌門的新種. 廣古菌門的所有基因型與在GenBank中最相似的菌種均為產甲烷古菌(Methanogenic archaea)，相似度均為82%~84%. 產甲烷古菌是一類嚴格厭氧的僅利用二氧化碳和氫氣、 甲酸鹽、 甲醇、 甲胺、 和/或乙酸鹽進行能量代謝并產生甲烷的古菌. 這類微生物在全球碳循環中發揮重要作用[46].

　　2.3.3 氨氧化古菌多樣性以及系統發育分析

　　該土壤樣品未擴增到氨氧化細菌的amoA基因片段，說明樣品中不存在氨氧化細菌或氨氧化細菌含量很低.

　　由古菌文庫組成可知本樣品中大多數古菌與氨氧化功能相關，故利用古菌特異性氨單加氧酶引物對AF和AR擴增氨單加氧酶基因序列，共得到39條有效基因序列. 經與GenBank數據庫中已有序列比對，發現該土壤樣品中多數氨氧化古菌的最相似序列來自酸性紅壤、 酸性土壤和酸性礦山等與本樣品所取條件相似的環境中，其中多數與已知菌種的相似性都低于90%，基因型AOA-XC-17和AOA-XC-19與Nitrosotalea devanaterra(阿伯丁土壤亞硝化細桿菌)的相似性都為94%. 從氨氧化古菌的系統發育樹(圖 6)可看出，Cluster 3中的基因型AOA-XC-1(文庫中豐度為5.1%)，AOA-XC-10(12.8%)，AOA-XC-13(10.3%)，AOA-XC-28(2.6%)，AOA-XC-33(2.6%)與數據庫中的氨氧化古菌序列相似性都較低，與已得到純培養的氨氧化古菌(全部位于Cluster 2中)親緣關系較遠，證明該土壤樣品中存在AOA新類群.

　　圖 6 基于amoA序列的氨氧化古菌(AOA)系統發育樹

　　3 討論

　　在前期研究中，筆者利用分子生物學的方法著重研究了取樣地的酸性礦山廢水庫的微生物群落結構和該區域內廢礦石中真核生物的多樣性[17,47]. 取樣區域AMD的pH在3以下[17]，周圍區域廢礦石的pH也低于3[47]. 本研究中的土壤樣品受到酸性礦山廢水的嚴重污染. 該樣品克隆文庫中細菌、 古菌序列在數據庫中的最相似序列多分離自酸性土壤、 酸性沼澤、 酸性紅壤以及酸性礦山等理化條件相似的環境中. 細菌文庫中最大的門類為酸桿菌門，在該門類中存在耐酸耐重金屬的類群. 此外，文庫中存在與反硝化作用相關的菌種，如Candidatus Koribacter versatilis、 紅游動菌屬(Rhodoplanes sp.)，也存在與鐵還原相關的菌種，如Aciditerrimonas ferrireducens，但未發現與氨氧化作用相關的菌種，說明該樣品中不存在或存在較少的氨氧化細菌. 而在古菌文庫中卻發現，大部分古菌是與氨氧化作用相關的奇古菌門的成員，且與已得到純培養的菌種親緣關系較遠. Nitrosotalea devanaterra是奇古菌門中唯一一種嗜酸的氨氧化古菌，但是該細菌與本研究中所有AOA序列的相似性都極低. 經建立古菌amoA克隆文庫，同樣證實該土壤樣品中存在氨氧化古菌，所以取樣區域內氨氧化過程主要由氨氧化古菌主導. 文庫中所得到的amoA序列與已得到純培養的氨氧化古菌的amoA序列相似性均低于85%，而且其中5種基因型與數據庫中已有研究的類群親緣關系較遠，在系統發育樹上組成一個獨立分枝，由此推斷該土壤中可能存在未知的氨氧化古菌類群. 礦區土壤由于其較低的pH和高重金屬含量使其具有特殊性，其中所含微生物對低pH和重金屬耐受性高，為今后礦區土壤以及理化性質相似的污染土壤的原位生物修復提供可靠依據.

　　4 結論

　　(1) 取樣區域土壤受到酸性礦山廢水的嚴重污染，pH僅為2.83，金屬Fe和Al含量都很高. 文庫中的序列均與酸性環境中檢測到的序列具有較高的同源性，證明該土壤中存在大量耐酸以及嗜酸的微生物.

　　(2) 細菌文庫覆蓋11個類群，酸桿菌門豐度近50%，第二大門類為疣微菌門，所占比例為18.9%. 古菌文庫多樣性低，只存在兩大門類，分別為奇古菌門和廣古菌門，前者占優勢地位.

　　(3) 細菌文庫中未發現與氨氧化作用相關的類群，只存在反硝化細菌參與N元素的生物地球化學循環. 該土壤樣品中的氨氧化作用主要由奇古菌門的氨氧化古菌所驅動，且該區域存在氨氧化古菌的新類群.(來源及其作者：中國地質大學(北京)水資源與環境學院 劉瑩、王麗華、郝春博、李璐、李思遠、馮傳平)